1915年3月10日，孙中山指示党务部发布第八号通告，揭露“二十一条”的交涉真相，把袁世凯的卖国勾当与复辟帝制阴谋联系起来，号召革命党人坚决进行反袁斗争。

1915年12月，袁世凯正在筹备他的登基大典，革命党人新的武装斗争也在组织发动当中。12月17日，奉孙中山的命令，李烈钧等革命党人入云南策动讨袁，又派人联系蔡锷，商议讨袁计划。25日，蔡锷、李烈钧、唐继尧等通电全国宣布云南独立，护国战争正式开始。
袁世凯在一片讨伐声中，于1916年3月22日宣布取消帝制。

为了加快组织反袁斗争，孙中山于4月从日本回国，在上海参与紧张的反袁起义活动。5月9日，孙中山在上海发表二次讨袁宣言，追溯袁世凯的窃国行径和几年来的中华革命党的反袁斗争，指出“袁氏未去，当与国民共任讨贼之事，袁氏既去，当与国民共荷监督之责，决不肯使谋危民国者，复生于国内。”

活动期间，孙中山的得力助手陈其美殉难，孙中山为其撰写《祭陈其美诔文》表达深刻的悲痛之情。